科研技術(shù)
檢測(cè)技術(shù)
發(fā)布：admin 發(fā)布時(shí)間：2017-11-21 來(lái)源：本站?
細(xì)胞總乙酰化水平的快速測(cè)定方法 -------免疫親和色譜-ELISA方法
步驟一：親和色譜分離提純乙酰化蛋白
1.用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，10000rpm離心2分鐘，取上清備用。
2.取20-40 μL抗乙酰化賴氨酸抗體填料(Anti-acetylated lysine Agarose,ICP0388)， 用PBS洗2次，每次1mL。
3.將細(xì)胞裂解上清液與洗好的填料（ICP0388）混勻，39oC旋轉(zhuǎn)搖床低速孵育60分鐘。
4.1000rpm離心1分鐘，去上清，用PBSt重懸沉淀，1000rpm離心1分鐘，去上清，重復(fù)3次，最后一次用PBS洗，吸棄上清。
注：細(xì)胞裂解液里應(yīng)該含有蛋白酶抑制劑，組蛋白乙酰化酶抑制劑等。
步驟二：釋放及包被固定分離提純的乙酰化蛋白
5.用20 μL0.1M HCL將步驟2的抗賴氨酸抗體填料-乙酰化蛋白復(fù)合物于沸水中煮2分鐘，10000rpm離心1分鐘，將上清液體全部轉(zhuǎn)移到含有80 μL的0.2M Na2CO3的ELISA薄板上，39oC孵育30分鐘；
6.取出ELISA薄板，拍干。用PBSt清洗2次，每次均需拍干。加入100 μL含0.5%BSA的PBSt ，39 ℃封閉10分鐘。
步驟三：用抗乙酰賴氨酸抗體HRP標(biāo)記物檢測(cè)蛋白乙酰化水平
7.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗2次，拍干。加入100 μL濃度為0.25 μg/mL抗賴氨酸抗體HRP偶聯(lián)復(fù)合物（Anti-acetylated lysine HRP conugates,ICP0381），39 ℃孵育30分鐘。
8.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗板孔3次，每次均需拍干。加入100 μLTMB液，39 ℃孵育顯色10-20分鐘。最后加入100 μL 0.1 M H2SO4終止反應(yīng)，在450nm波長(zhǎng)下讀數(shù)。