科研技術(shù)
檢測(cè)技術(shù)
發(fā)布：奧思特科技 發(fā)布時(shí)間：2017-11-06 來(lái)源：本站免疫組化實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)
1、免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些？
實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過(guò)程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。
2、石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？
石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。
3、免疫組化常用的染色方法有哪些？
根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗體）在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
4、石蠟切片在染色過(guò)程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象
1）烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長(zhǎng)烤片時(shí)間和提高烤片溫度；
2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購(gòu)買到或這自己做；
3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；
4）用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。
5、邊緣效應(yīng)
1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；
2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫(huà)圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫(huà)圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。
6、產(chǎn)生組織切片非特異性染色
1）抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條；
2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；
3）內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；
4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；
5）DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高；
6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；
7）標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。
7、免疫組化染色呈陰性結(jié)果
1）抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤；
2）抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開(kāi)抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)；
3）組織切片本身這種抗原含量低；
4）血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；
5）DAB孵育時(shí)間過(guò)短；
6）細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)；
7）開(kāi)始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。
8、背景
1）考慮一抗?jié)舛雀撸?/p>
2）然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間；
3）也要考慮血清封閉時(shí)間是否過(guò)短；
4）適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長(zhǎng)浸洗時(shí)間等